Tutto quello che sappiamo di San Barnaba si trova nel Nuovo Testamento. Ebreo nato a Cipro e chiamato Giuseppe, vendette la sua proprietà, diede il ricavato agli Apostoli, che gli diedero il nome Barnaba, e visse in comune con i primi convertiti al cristianesimo a Gerusalemme. Originariamente un levita, si pensa che fosse un ebreo ellenizzato e che fosse uno degli apostoli degli anni 70 (o 72). Convinse la comunità lì ad accettare Paolo come discepolo, fu mandato ad Antiochia per esaminare la comunità lì e portò Paolo lì da Tarso. Con Paolo portò la donazione di Antiochia alla comunità di Gerusalemme durante una carestia e tornò ad Antiochia con Giovanni Marco, suo cugino. Si dice che sia stato tra i fondatori della chiesa di Antiochia in Pisidia. Presentò Paolo agli apostoli dopo la sua conversione. I tre intrapresero un viaggio missionario a Cipro, Perge (quando Giovanni Marco andò a Gerusalemme) e Antiochia a Pisidia, dove furono così violentemente osteggiati dagli ebrei che decisero di predicare ai pagani. Poi andarono a Iconio (odierna Konya) e Listra in Licaonia, dove furono prima acclamati dei e poi lapidati fuori dalla città, e poi tornarono ad Antiochia.
Quando sorse una disputa sull'osservanza dei riti giudaici, San Paolo e Barnaba si recarono a Gerusalemme, dove, in un concilio, fu deciso che i pagani non dovevano essere circoncisi per essere battezzati. Al loro ritorno ad Antiochia Barnaba volle portare Giovanni Marco in un'altra visita nelle città in cui avevano predicato, ma Paolo si oppose a causa dell'abbandono di Giovanni Marco a Perge. Paolo e Barnaba si separarono e Barnaba tornò a Cipro con Marco. Non si sa più nulla di lui, anche se si ritiene che la sua frattura con Paolo alla fine sia stata sanata. La tradizione vuole che Barnaba predichi ad Alessandria e Roma, il fondatore della chiesa cipriota, il vescovo di Milano (cosa che non era), e lo fece lapidare a Salamina intorno all'anno 61. L'epistola apocrifa di Barnaba è stata a lungo attribuita a lui, ma gli studiosi moderni ora lo attribuiscono a un cristiano ad Alessandria tra gli anni 70 e 100. Il Vangelo di Barnaba è probabilmente di un cristiano italiano che divenne un maomettano; e si sa che gli Atti di Barnaba un tempo attribuiti a Giovanni Marco furono scritti nel V secolo. La sua festa è l'11 giugno.
È tradizionalmente considerato il fondatore della chiesa cipriota e per essere stato martirizzato a Salamina circa nel 61. Alcuni dicono che abbia fondato la Sede di Milano. Tertulliano disse che Barnaba, non Paolo, scrisse l'epistola agli Ebrei, e l'Epistola di Barnaba è di paternità sconosciuta. Barnaba è stato uno dei santi più importanti della cristianità.